分光光度法的基础知识

棱镜-1

我们日常生活中的颜色无处不在。你知道你可以测量颜色吗?在分析化学和生物样品时,分光光度计是生物学家和技术人员必不可少的工具。

本博客将介绍分光光度法的一些基础知识和不同的配置。 

 

光和颜色

比色波

简单来说,颜色取决于光线。我们实际上并没有看到颜色,我们所看到的颜色是光照在物体上的效果。当白光照射在物体上时,它可能被反射,吸收或透射。玻璃透射大部分与其接触的光,因此看起来是无色的。雪反射所有光线并呈现白色。黑布吸收所有光线,因此显得黑色。红色纸反射红光比反射其他颜色更好。大多数物体看起来是有色的,因为它们的化学结构吸收某些波长的光并反射其他物

讨论光时,我们通常指的是白光。细线称为光线; 光束由许多光线组成。当白光穿过棱镜(三角形透明物体)时,构成白光的颜色分散成七个色带。这些颜色带称为光谱。七种颜色构成白光:红色,橙色,黄色,绿色,蓝色,靛蓝色和紫罗兰色。在任何光谱中,颜色带总是按从左到右的顺序组织。

假设我们在一种吸收蓝光的物质上发出一束白光。由于白光的蓝色成分被物质吸收,所以透射的光大多是黄色,蓝色的互补色。这黄色的光照射到我们的眼睛,我们“看到”这种物质是一种黄色的物质。

经历一些组分浓度变化的系统的颜色变化是比色分析的基础。

比色分析

什么是Colorimetery?

比色法只是颜色的测量。比色法是通过测量光相对于已知物质浓度的相对吸收来确定物质的浓度。在视觉比色法中,通常使用自然或人造白光作为光源,并且通常使用称为比色计或颜色比较器的简单仪器进行测定。当用光电池代替眼睛时,该仪器被称为光电色度计。

比色分析基于以下原理:许多物质彼此反应并形成可以指示待测物质浓度的颜色。当物质暴露于光束强度(I 0)时,一部分辐射被物质分子吸收,并发射强度(I)的辐射。这种强度差异用于比色测定。

吸收的辐射量由Beer-Lambert定律给出:

 

A =Ɛ·l·C

 

A是吸光度

Ɛ    是摩尔消光系数[L /(mol·cm)]

l  是路径长度(cm)    

C是浓度(mol /升)

 

光度计与分光光度计

光度计

光度计通过使用滤光器隔离特定波长的光。色度计使用边带滤波器或类似系统将光分离成颜色分量,然后将其与基于人眼的匹配曲线拟合,以基于人眼将看到的内容产生颜色值。这是匹配人类视觉反应的理想选择,但不会告诉您人眼不可见的数据,例如光谱中窄点的发射尖峰; 这是光谱数据,需要分光光度计。

光度计 - 水 - 分析 - 台式-HI83200

分光光度计

分光光度计与光度计不同,因为它们允许在所有可见光波长的光谱中进行测量,而不仅仅是预先指定的波长。分光光度计的工作原理是将特定波长的光与白光隔离。分光光度计使用彩色光栅或类似系统将光线分解成光谱。然后,一系列传感器读取光谱的每个部分,产生光谱数据。如果您正在分析灯泡,恒星或其他光源的光谱发射,这是理想的选择,这就是分光光度计经常用作科学设备的原因。

HI801_iris_Spectrophotometer

分光光度计的光学配置

单光束

在传统的单光束分光光度计中,连续测量空白和样品,单个波长测量间隔为几秒,使用常规仪器进行全光谱测量时间间隔为几分钟。灯漂移可能会在很长的时间间隔内导致严重错误。

单梁

双光束

开发了双光束或双光束分光光度计,以补偿空白和样品比色皿测量之间灯强度的这些变化。在这种配置中,光源发射单个光束,该光束被斩波器分开,产生两个相等能量的光束,具有相同的光路。一束光线穿过参考光束,而另一束光束穿过样品。

与单光束设计相比,双光束仪器包含更多的光学元件,从而降低了产量和灵敏度。对于高灵敏度,可能需要很长的测量时间。此外,双光束分光光度计的更复杂的机械设计可能导致更差的可靠性。

双光束

分裂光束

分光束分光光度计类似于双光束分光光度计,但使用分束器代替斩波器将空白和样品路径的光线同时发送到两个独立但相同的检测器。该配置使得能够同时测量坯料和样品。分束设计比真正的双光束仪器机械简单,并且需要更少的光学元件。

 

分光光度计的**佳用途 

今天的分光光度计设计既耐用又便携,使用灵活。 虽然应用程序几乎无穷无尽,但一些**佳用途包括:

  • 水质的元素测定
  • 葡萄酒中的酶分析
  • 农业肥料特性分析

这些只是分光光度计的许多潜在用途中的一部分。